Малахітовий зелений. Метод Шефера - Фултона 
для виявлення ендоспор бактерій

Малахітовий зелений  – триариалметановий барвник катіонного типу. На вигляд зелені кристали з золотим блиском, забарвлення подібне до кольору мінералу малахіту, від якого власне і походить назва барвнику. Лінія максимуму поглинання 621 нм. Розчиняється у воді, етанолі, метанолі. Розчинність 100 г/л. Використовується як індикатор, реагент для фотометричного визначення титану (ІV), фосфору, вольфраму, сульфітів і як барвник у мікробіології та мікроскопії для забарвлення клітинних ядер, еритроцитів, яєць аскарид. У минулому використовувався для фарбування тканини, шкіри та паперу та для боротьби з іхтіофтіріозом, триходинозом та іншими ектопаразитарними та бактеріальними хворобами риб. Але зараз використання малахітового зеленого через токсичність та канцерогенність у текстильній та рибній промисловості майже зупинилося.

Малахітовий зелений як індикатор для неводного титрування

Розчинник: оцтова кислота – пропіонова кислота. Перехід забарвлення від лужного до кислого середовища: синє – зелене – жовте.

Розчинник: оцтова кислота – оцтовий ангідрид. Перехід забарвлення від кислого до лужного середовища: відтитровують ацетатом натрію: зелено-жовте – зелене.

Приготування розчину індикатору:
0,5 г препарату розчиняють у 100 см3 оцтової кислоти.

Малахітовий зелений як кислотно-основний індикатор

Інтервал рН переходу забарвлення: перший перехід рН 0,1-2,0; другий перехід рН 1,4-13,0.

Зміна забарвлення: перший перехід: у кислому середовищі – жовте, у лужному – голубувато-зелене; другий перехід: у кислому середовищі – голубувато-зелене, у лужному – безбарвне.

Приготування розчину індикатору: 0,1 г препарату розчиняють у 100 см3 дистильованої води або 0,1 г препарату розчиняють у 100 см3 етанолу з масовою часткою 20%.

Барвник у мікробіології

У 1930 році мікробіологи Еліс Шеффер і Макдональд Фултон для  виявлення  ендоспор запропонували використовувати малахітовий зелений і сафранін (Shaeffer-Fulton method). Цей метод забарвлення найбільш широко застосовується у лабораторіях. Іноді його називають на честь двох бактеріологів 1900-хроків – Віртца і Конкліна (Wirtz-Conklin modified spore stain).

Він передбачає три-чотириразове підігрівання фіксованого препарату над полум’ям пальника до появи парів або прогрівання над ванночкою з окропом впродовж 5-6 хвилин у 5% водному розчині малахітового зеленого, охолодження, промивання водою та фарбування препарату розведеним водним розчином сафраніну- О (0,5% - впродовж 30 секунд або 0,1% - впродовж 3 хвилин).

Малахітовий зелений потрапляє у вегетативні клітини, а при підігріванні проникає в ендоспору. При промиванні водою барвник видаляється з вегетативної клітини, бо слабо зв’язується з її структурами. Натомість він не може видалитися зі спор. Знебарвлена вегетативна клітина забарвлюється сафраніном.
Цей механізм забарвлення справедливий для інших принципово подібних методів. Вони відрізняються між собою барвниками, способами забезпечення проникнення барвників у спори та знебарвлення вегетативних клітин.

Метод забарвлення Віртца-Конкліна вигідно вирізняється з-поміж інших тим, що дозволяє диференціювати спори на стадіях спокою та проростання. Спори на стадії спокою набувають зеленого забарвлення, а вегетативні тіла бактерій та спори на стадії проростання – рожевого. Застосування цього методу забарвлення виявляє початок проростання спор вже через 30 хвилин після їх інкубації в середовищі проростання.

Для виявлення ендоспор бактерій можна застосувати метод Шефера - Фултона

Для проведення цього фарбування слід виконати наступні дії:  
1.На знежирене предметне скло нанести дві краплі стерильної води .  
2.Петлею внести культури та суспензувати їх.
3.Висушити препарат на повітрі, зафіксувати жаром.
4.На препарат покласти смужки фільтрувального паперу, наситити їх розчином малахітового зеленого і щільно притиснути папір до мазків. Барвник нагрівати на водяній бані протягом 10 хвилин або над полум'ям пальника протягом 5 хвилин, не допускаючи висихання. При необхідності слід додавати барвник.
5.Препарат добре промити водою.
6.Препарат додатково дофарбувати водним розчином фуксину протягом 30 с.
7.Препарат промити і висушити на повітрі та промікроскопіювати з імерсією.

У полі зору: спори яскраво-зелені, а клітини – червоні.

Реакція формальдегіду з малахітовим зеленим

Малахітовий зелений є трифенілметановим барвником. При взаємодії з сульфітною кислотою хіноїдна структура барвника руйнується, при цьому утворюється незабарвлена сульфонова лейкокислота малахітового зеленого. При додаванні альдегіду від молекули лейкосульфокислоти відщеплюється сульфогрупа, що зв’язана з атомом карбону, і утворюється хіноїдний барвник зеленого кольору. Альдегід при цьому перетворюється у гідросульфітну похідну. Схема утворення барвник-сульфонової кислоти з малахітовим зеленим та її взаємодія з альдегідом така:

В реакцію вступають аліфатичні альдегіди та ацетон. Гліоксаль, цукри, ароматичні гідроксиальдегіди, α,β-ненасичені альдегіди не реагують. Заважають
сполуки, що легко взаємодіють з SO2: окисники, аміни, тощо.

Замість малахітового зеленого можна використати діамантовий зелений або фуксин, однак фуксин є набагато небезбечнішим, ніж інші два барвники, оскільки має
канцерогенні властивості.

Виконання реакції

Декілька крапель водного нейтрального розчину альдегіду за допомогою капіляру поміщають на індикаторний папір, що просочений лейкосульфокислотою малахітового зеленого, через 1- 2 хвилини спостерігають утворення зеленої плями малахітового зеленого.

Приготування індикаторного папірця, просоченого лейкосульфокислотою малахітового зеленого: 0,1 ‒ 0,3 г малахітового зеленого додають до 6 ‒ 10 мл води і переводять в розчин, додаючи 3 ‒ 5 г натрій сульфіту при нагріванні, розчин фільтрують. В холодний жовтуватий фільтрат занурюють смужки тонкого фільтрувального паперу і висушують їх на повітрі.

Фотометричне визначення Р(V) у вигляді іонного асоціату молібдофосфатної гетерополікислоти з малахітовим зеленим

У конічну пробірку місткістю 10 см3 вносять 0,1 см3 розчину золи продукту, додають 2 см3 2 моль/дм3 нітратної кислоти, 0,4 см3 0,24 моль/дм3 розчину молібдату натрію, 1 см3 0,1% водяного розчину малахітового зеленого (МЛЗ) водою доводять до мітки, перемішують паличкою до утворення темно-зелених пластівців іонного асоціату молібдофосфатної гетерополікислоти  з малахітовим зеленим.

Суміш центрифугують впродовж 2 хв (3000 об/хв). Центрифугат зливають. До осаду додають 10 см3 води, перемішують паличкою для промивання осаду іонного асоціату від залишку МЛЗ, знову центрифугують впродовж 2 хв.

Центрифугат зливають, додають 10 см3 ацетону для розчинення осаду, розчин переливають у мірну колбу місткістю 100 см3. У пробірку додають ще 10 см3 ацетону для повного розчинення залишків осаду і переливають в мірну колбу з попередньою порцією ацетонового розчину іонного асоціату. Розчин у колбі доводять до мітки водою і перемішують. При цьому осад повністю розчиняється. Оптичну густину розчину вимірюють в кюветі з l=1 см при λ=620 нм відносно води.

Малахітовий зелений у протикорозійних пігментах

Синтезовані протикорозійні фосфатовмісні пігменти як на основі модифікованого ортофосфорною кислотою монтморилоніту, так і шляхом коінтеркаляції неорганічної матриці монтморилоніту молекулами ортофосфорної кислоти та малахітового зеленого при концентрації 2·10-2 моль/л для адсорбційних лаків.  Визначені фізико-технічні властивості пігментів: олієємкість першого роду - 44г/100г та 66г/100г, укривність - 280г/м2 та 680 г/м2, рН=7-9 відповідно для пігментів зеленого кольору. Механізм протикорозійної дії пігментів обумовлений бар’єрним ефектом та утворенням комплексних інгібіторів корозії на анодних ділянках за участі іонів заліза, фосфат-іонів а також функціональних ОН- та СООН-груп органічних олігомерів.  Сформульовані рекомендації щодо застосування нових пігментів у таких протикорозійних лакофарбових матеріалах як  грунт ГФ-021, грунт ГФ-0119 та грунт-емаль УРФ-1101.

Вилучення барвнику із водної фази для очищення стічних вод

Флотоекстракція є видозміною екстракції, яка надзвичайно посилена ефектом концентрування за рахунок пухирців газу, які підвищують концентрацію сублату при масопереносі через границю розділу фаз.

В якості ПАР було обрано додецилсульфат натрію тому, що з ним досягалися найвищі ступені очищення. Кращими екстрагентами виявилися спирти з розгалуженою будовою ланцюга, що пояснюється просторовими ефектами, за рахунок яких порівняно великий за розміром сублат важко утримується нерозгалуженою структурою.

Експериментально було обрано ізоаміловий спирт в якості екстрагенту, оскільки з ним спостерігаються найвищі ступені видалення малахітового зеленого - 95,78 %. Кислотність середовища суттєво впливає на ступінь вилучення барвника. Немає необхідності коригування кислотності середовища, оскільки вихідний розчин барвнику має значення pH при якому досягається максимальний ступінь видалення.

Оптимальним співвідношенням Барвник: ПАР є значення 1:1. Оптимальним часом проведення флотоекстракції можна вважати 20 хв. За цей час досягається максимальний ступінь вилучення. Для значення вихідної концентрації розчину малахітового зеленого 10 мг/л очищення досягає значення 95,7 %. При збільшенні концентрації до 50 і 100 мг/л помітний вплив на ступінь вилучення барвнику не спостерігається, результати знаходяться в межах похибки експерименту.

Запропонований метод забезпечує достатній рівень очищення стічних вод від барвників. Він також може бути застосований в системах локального очищення стоків з наступним поверненням води у технологічний процес. Це забезпечить зниження витрат на споживання водних ресурсів, скидання стічних вод у водні об'єкти, а також обмежить потрапляння шкідливих речовин у навколишнє середовище. Особливості флотоекстракції дозволяють регенерувати екстрагент та ПАР.