Бромтимоловий синій. Кислотно-основний індикатор

Бромтимоловий синій, також відомий як дибромтимолсульфофталеїн, є сульфонованим гідроксихіноном у кислотних водних розчинах. Це pH-чутливий барвник, який змінює колір з жовтого на синій.

Сфери застосування:
Кислотно-основний індикатор

• інтервал рН переходу зображення від жовтого до синього становить 5,8-7,6
• у складі змішаних кислотно-основних індикаторів з бромкрезоловим пурпурним, феноловим червоним, метиловим червоним
• є одним з компонентів універсального індикатора

Біологічний та хімічний аналіз

• реагент у багатьох методиках спектрофотометричного аналізу
• для фарбування клітин у мікроскопії
• інгібітор аніонної транслокації через мембрани мітохондрій
• індикатор для дослідження фотосинтезу
• складова бактеріальних середовищ та субстратів
• додають до агару для енумерації Bacillus cereus

Приготування лужного розчину індикатора бромтимолового синього

0,05 г бромтимолового синього розтерти у порцеляновій ступці з 3,2 мл натрію гідроксиду молярної концентрації 0,05 моль/л і після його повного розчинення довести об’єм дистильованою водою до 100 мл.

Приготування водно-спиртового розчину індикатора бромтимолового синього

0,05 г бромтимолового синього розчинити у 100 мл етанолу з масовою часткою 20 % або 0,1 г бромтимолового синього розчинити у 50 мл етанолу з масовою часткою 96 % і довести об’єм розчину дистильованою водою до 100 мл.

Визначення рівноважних структур бромтимолового синього за допомогою квантової хімії з використанням багатовимірного аналізу спектрів абсорбції

Бромтимоловий синій (БТС) є кислотно-основним індикатором, який належить до класу сульфофталеїнових барвників. Водний розчин БТС має жовте забарвлення у слабокислому середовищі (рН 6,0) та змінює колір на синій (рН 7,6), з проміжним зеленим, при підвищенні рН. Зелений колір має розчин БТС при майже нейтральному рН (близько 7). Тому БТС є одним з найбільш зручних індикаторів для розрізнення кислотності, нейтральності та лужності водних розчинів. Бромтимоловий синій називається галохромним матеріалом, який вже давно широко вивчається як з наукової, так і з практичної точки зору.

Незважаючи на широке використання БТС як кислотно-основного індикатора, зв'язок між хімічною структурою та кольором все ще залишається дискусійним. У 1979 році Мачіда разом з іншими вченими вивчали структури сульфофталеїнових барвників, включаючи БТС, за допомогою раманівської спектроскопії. Вони вимірювали резонансні раманівські спектри дев'яти сульфофталеїнових барвників та двох еталонних сполук, аурину та бензаурину, у водних розчинах при різних значеннях рН від 4,0 до 11,0 і дійшли висновку, що барвники набувають чистої хіноїдної форми в кислому розчині, а у лужному розчині - хіноїдно-фенольної форми. Незважаючи на їхнє точне структурне дослідження за допомогою вібраційної спектроскопії, яка є одним з найпотужніших інструментів для структурного визначення, все ще існує принаймні три різні шляхи структурної зміни між жовтою та синьою формами. Структури БТС, запропоновані в раманівському дослідженні, нещодавно були проаналізовані за допомогою експериментальних і теоретичних підходів, і запропоновані структури виявилися логічними. Однак основним інтересом дослідження не була структурна трансформація молекули БТС залежно від рН, а вплив замісників сульфофталеїнових сполук у широкому діапазоні рН. Для остаточного вирішення спірного структурного питання необхідне додаткове дослідження, яке безпосередньо приділяє увагу структурній трансформації БТС.

Матеріали та приготування розчинів

• Бромтимоловий синій, водний розчин, 1,6 × 10−5 моль/л: 0,5 мл розчину було розведено до 20,0 мл за допомогою фосфатного буферного розчину для отримання концентрації 1,6 × 10−5 моль/л
• Фосфатний буферний розчин з рН від 4,5 до 11,0 з інтервалом 0,5 одиниці рН був приготований з іонною силою 0,025 моль/л, 0,05 моль/л, 0,1 моль/л, 0,15 моль/л та 0,2 моль/л. Концентрація фосфатного буферного розчину з постійною іонною силою була розрахована за допомогою комп'ютерної програми Acid-Base-Program: ActpH. Варто зазначити, що було неможливо розрахувати фосфатний буферний розчин з рН 4,5 для низької іонної сили, такої як 0,025 моль/л та 0,05 моль/л, тому вони були винятково розраховані на рН 4,86 та 4,70 відповідно.

Обладнання

Для реєстрації спектрів електронного поглинання водного розчину БТС з різними значеннями рН та іонною силою використовувався V-670 UV–Visible/NIR спектрометр JASCO (Токіо, Японія) з кварцовою кюветою довжиною оптичного шляху 10 мм. Для фонового вимірювання використовували ті ж самі буферні розчини без БТС. Усі спектроскопічні вимірювання проводилися при 25 °C, що контролювалося за допомогою термостатованого однопозиційного кюветотримача JASCO ETCS-761 (з водяним охолодженням).

Багатовимірний аналіз

Багатовимірний аналіз головних компонент (PCA) та альтернатої регресії найменших квадратів (ALS) електронного спектрів поглинання був проведений на MathWorks (Natick, MA, USA) MATLAB 2009a для Windows з використаням власної програми.

Обчислювальні методи

Оптимізація структур була проведена за допомогою методу теорії функціональної густини (DFT). Цей метод є достатньо точним для дослідження великої молекули індикатора з низькою обчислювальною вартістю. Спектри електронного поглинання були симульовані з використанням 30 збуджених станів, отриманих за допомогою методу залежної від часу теорії функціональної густини (TD-DFT). Усі розрахунки були виконані в Gaussian 03 з використанням функціонала B3LYP з базисним набором 6–31+G(d, p).

Обговорення результатів

Типові спектри електронного поглинання, виміряні під час перетворення БТС з жовтої форми в синю зображені на рисунку.

Спектри були отримані при чотирнадцяти різних значеннях рН від 4,5 до 11,0 і постійній іонній силі 0,1 моль/л з фосфатним буферним розчином. При низькому рН жовта форма проявляє максимум поглинання приблизно при 433,0 нм; тоді як синя форма має пік приблизно при 615,5 нм при високому рН. Ізобестичні точки явно розпізнаються при 324,5 нм і 498,5 нм, що означає, що спектральні варіації легко пояснюються лише двома хімічними компонентами. Такі ж тенденції були виявлені і для інших іонних сил: 0,025 моль/л, 0,05 моль/л, 0,15 моль/л і 0,2 моль/л (спектри не показані).

Аналіз головних компонент

Кількість хімічних компонентів, які впливають на спектральні варіації залежно від рН, аналізується за допомогою PCA. PCA часто називають аналізом власних значень, оскільки PCA може зводитися до стандартної задачі власних значень: «вектори навантаження» та дисперсії «балів» PCA відповідають власним векторам та власним значенням. Якщо несподівані незначні види співіснують з двома основними видами, як це показано ізобестичними точками, більше двох власних значень повинні бути значно більшими, ніж власні значення факторів шуму. Перші десять власних значень, розрахованих для 14 спектрів електронного поглинання з постійною іонною силою 0,1 моль/л, показані на рисунку.

Графік явно показує, що лише перші два хімічні компоненти є достатніми для кількісного обговорення, оскільки третій фактор приблизно в 1000000 разів менший за другий фактор, що підтверджує прогноз за ізобестичними точками. Такі ж результати кількості хімічних компонентів були отримані і для інших іонних сил.

Висновок про лише два хімічні компоненти є дуже цікавим, оскільки під час зміни рН спостерігаються три кольори (жовтий, зелений і синій). Це свідчить про те, що зелений колір у нейтральному розчині утворюється в результаті суміші жовтого і синього, що підтверджується наступними аналізами.

Визначення pKa'

Точне значення pKa' для кожної іонної сили визначається наступним чином. Зміна з жовтої структури на синю виражається рівнянням:

де HInz і Inz-1 позначають протоновану форму із зарядом z та депротоновану форму із зарядом z-1 відповідно. З цими хімічними видами практична константа кислотної дисоціації Ka' записується наступним чином:

де дужки [] представляють молярну концентрацію, а aH+ - це активність іона водню, яка пов'язана з виміряним значенням pH через рівняння aH+ = 10^(-pH). Як було встановлено в попередньому розділі, сума концентрацій [HInz] + [Inz-1] зберігається під час реакції і повинна дорівнювати одиниці. Тоді рівняння має вигляд:

Зміна концентрації синьої форми в залежності від pH на рисунку була підігнана рівнянням, і невідомий параметр Ka' був розв'язаний.

Найкраща підігнана крива при постійній іонній силі 0,1 моль/л накладена на графік суцільною синьою лінією, що дає pKa' 7,24. Аналогічно, підігнана крива для зміни жовтої форми також отримана як суцільна жовта лінія, яка обчислюється за формулою [HInz] = 1 - [Inz-1]. Значення pKa' для інших іонних сил також були визначені тим самим способом і зображені на рисунку кружечками. Значення pKa' для БТС демонструє тенденцію до зменшення зі збільшенням іонної сили.

Структура жовтої форми БТС

На основі кількості зарядів, показаних у попередньому розділі, молекулярна структура жовтої форми може мати три можливі структури, як зображено на рисунку.

Для визначення найбільш правдоподібної структури використовується квантово-хімічний розрахунок. Серед трьох структур оптимізована структура 3 у газовій фазі виявилася нестійкою і розпадалася по внутрішньому зв'язку між атомом кисню та центральним атомом вуглецю. Нестабільність повинна бути пов'язана з тим, що тільки структура 3 не має сполучених систем навколо центрального атома вуглецю. Структура з розірваним кільцем повинна бути більш стабільною у водному розчині через гідратацію іонів.

Форма структури 3 з розірваним кільцем також очікується з точки зору кольору. Загалом, колір кислотно-основного індикатора виникає внаслідок високосполученої структури. Однак закрите кільце порушує сполучену структуру. Тому структура 3 не може проявляти видимого кольору, що слід виключити з кандидатів. Обчислення TD-DFT структури 3, фактично, не показує електронного поглинання у видимому діапазоні світла (дані не показані).

Енергії стабілізації гідратованих структур 1 і 2 були розраховані після структурної оптимізації в газовій фазі. Сольватація моделювалася за допомогою стандартного самоузгодженого поля реакції (SCRF) у Gaussian 03. В результаті було встановлено, що жовта форма приймає структуру 2, тобто однозарядний аніон хіноїдної форми. З точки зору енергії, структура 2 є більш стабільною, ніж структура 1, на 74,49 кДж/моль. Цей результат є розумним з точки зору кислотності: депротонування природно відбувається у сильнішій кислотній групі. При порівнянні кислотності між структурами 1 і 2, сульфонільна гідроксильна група (-SO3H) структури 2 є сильнішою, ніж гідроксильна група (-OH) структури 1.

Структура синьої форми БТС

Зі збільшенням рН жовтого розчину інший протон структури 2 дисоціює, в результаті чого утворюється двовалентний аніон (In2-; синя форма). Дисоційований протон у структурі 2 повинен бути віднесений до фенольної частини. Коли враховується резонансний гібрид після дисоціації, синя форма повинна включати хіноїдно-фенольний гібрид, як показано на правій стороні рисунку.

Бромтимоловий синій для виявлення фальсифікації молока

Фальсифікація якості молока може відбуватися за рахунок розбавлення молока водою, додаванням до прокислого молока речовин лужного характеру (наприклад соди), додаванням до знежиреного молока крохмалю або борошна для підвищення його густини. Соду додають у молоко з метою нейтралізації кислот, що утворюються при його скисанні. Для визначення вмісту соди використовують реакцію з індикатором бромтимоловим синім, в разі його додавання молоко, в якому присутня сода, забарвлюється в синій колір, за відсутності – жовтий.

Бромтимоловий як індикатор у мікробіології

У результаті дослідження вчених О.Б. Таширев, І.Б. Сіома, Г.О. Таширева, В.М. Говоруха з Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України вперше показано, що бромтимоловий синій (БТС) є універсальним індикатором для визначення фізико-хімічних параметрів (рН, Eh) під час гетерофазної твердофазної ферментації мікроорганізмами.

Використання розчину бромтимолового синього дозволяє візуально контролювати динаміку значення рН у діапазоні від 4,5 до 7,5 і Eh ≥ –200 мВ (при рН 7,0). Застосування БТС у гетерофазній ферментації твердого субстрату дозволяє візуалізувати зони зі зміненим рН та Eh, їх стереометричний розподіл та зміну конфігурації з часом. Застосування БТС як індикатора Eh та рН дозволяє оптимізувати процес розробки нових біотехнологій з використанням умов гетерофазного культивування.

Матеріали та методи

Для прямого вимірювання значення окисно-відновного потенціалу (Eh) утворення лейкоформи БТС використовували сильний відновник - цитрат титану, який може знизити окисно-відновний потенціал розчинів (включаючи культуральне середовище) до -400 мВ і нижче.

Приготування розчину бромтимолового синього:

Для отримання візуально помітного кольору культурального середовища додавали до нього насичений водний розчин БТС у співвідношенні 0,75 мл на 1 літр середовища. Насичений розчин БТС отримували шляхом розчинення надлишку БТС у дистильованій водітемпературою 60°C з подальшим охолодженням до температури 20°C.

Приготування відновника:

Використовували стерильний розчин титану(III) цитрату за Зехндера у модифікації Таширєва для оцінки значення Eh, яке призводить до знебарвлення БТС. Цитрат Ti(III) має Eh = -600…-680 мВ і рН 7,0.

Оцінка значення окисно-відновного потенціалу знебарвлення бромтимолового синього:

Для визначення Eh деколоризації БТС його відновлювали в дистильованому водному розчині шляхом додавання цитрату Ti(III). Дистильовану воду (40 мл) заливали в стакан (50 мл), а потім додавали насичений розчин БТС до появи візуально помітного жовто-зеленого кольору. Характеристики розчину були наступними: рН 6,49 і Eh +390 мВ. Стакан закріплювали на штативі для подальшого вимірювання рН та Eh. Верхня частина стакана над поверхнею розчину була під потоком стерильного аргону.

Відновник додавали краплями, щоб поступово знизити значення окисно-відновного потенціалу внаслідок збільшення концентрації відновника в середовищі. Цитрат Ti(III) додавали до розчину до моменту повного знебарвлення БТС. Наявність електродів дозволяла точно відстежувати значення окисно-відновного потенціалу.

Окисно-відновний потенціал (Eh) та рН середовища вимірювали за допомогою рН-метра-мілівольтметра "рН-150 МА" з використанням трьох електродів. Для вимірювання Eh використовували платиновий електрод у парі з хлор-срібним порівняльним електродом, а для вимірювання рН - скляний електрод. Перед вимірюванням електроди калібрували стандартними буферними розчинами. Для калібрування рН використовували стандартні буферні розчини рН: розчин KH2PO4 (рН = 1,68), NaH2PO4 (рН = 6,86) та Na2B4O7·10H2O (рН = 9,18). Стандартні буферні розчини рН готували відповідно до інструкції виробника. Для перевірки правильності вимірювання Eh використовували три буферні розчини: фериціанідний з Eh = +273 мВ (13,5 г/л K3[Fe(CN)6] і 3,8 г/л K4[Fe(CN)6]·3Н2О), Fe(II) цитрат (10 г Fe(II) в 1 літрі) з Eh = -150 мВ [13] та Ti(III) цитрат 1,5% з Eh = -440 мВ.

Гетерофазне культивування

Для визначення стереометричного градієнта Eh та рН за допомогою БТС в умовах гетерофазного культивування ми використовували ферментацію подрібненої картоплі ґрунтовими спороутворюючими мікроорганізмами (Bacillus spp. та Clostridium spp.). У пляшки місткістю  250 мл поміщали 50 г картоплі (кубики розміром 1 см3) та 1 мл інокуляту. Субстрат та інокулят попередньо нагрівали при 100°C протягом 5 хвилин. Цей захід використовується для усунення небажаних фізіологічних груп мікроорганізмів, які можуть конкурувати з клостридіями за джерела вуглецю та енергії або знижувати ефективність синтезу водню.

\Мікробна колонія знижує окисно-відновний потенціал середовища на сотні мілівольт. Раніше було показано, що в процесі ферментації картоплі параметри середовища змінюються в дуже широкому діапазоні (рН від 7,8 до 3,5 і Eh від +470 до -270 мВ).

Субстрат та інокулят попередньо кип’ятили протягом 5 хвилин. Це запобігло появі неспороутворюючих мікроорганізмів, які могли б конкурувати з продуцентами водню за субстрат. Культивування відбувалося при 21°С.

Зміни кольору індикатора визначалися візуально. На основі отриманих даних було визначено просторовий розподіл значень рН та Eh в процесі гетерофазного культивування.

Використання бромтимолового синього у спектрофотометричних методиках для кількісного визначення речовин у фармацевтичному аналізі

Українські вчені з Запорізького державного медичного університу разом з Науково-дослідним експертно-криміналістичним центром при ГУМВС України в Запорізькій області розробобили високочутливу, просту у виконанні і валідну спектрофотометричної методики для кількісного визначення зопіклону в лікарських формах на основі реакції з бромтимоловим синім.

Зопіклон (6-(5-хлор-2-піридиніл)-6,7-дигідро-7- оксо-5H-пірроло[3,4-b]піразин-5-іловий естер 4-метил-1-піперазінкарбонової кислоти) – агоніст бензодіазепінових рецепторів, діє на центральні рецептори макромолекулярного ГАМК (гамма-аміномасляна кислота) бензодіазепін-хлоріонофорного комплексу і не діє на периферичні бензодіазепінові рецептори. Підвищує чутливість ГАМК-рецепторів до медіатора, що призводить до гальмування міжнейронної передачі в різних відділах центральної нервової системи. Скорочує період
засинання, зменшує кількість нічних пробуджень, покращує якість сну, не змінює фазову структуру сну. Зопіклон ефективний при ситуативному безсонні, що пов’язане з психоемоційним напруженням, зміною звичного ритму життя (наприклад, при госпіталізації), десинхронозом, у т.ч. при зміні часових поясів, позмінному режимі роботи. Сон настає протягом 20–30 хв після приймання і триває 6–8 год.

Результати та їх обговорення

Аналітичне застосування сульфофталеїнових барвників відоме для кількісного визначення препаратів різних фармакологічних і хімічних груп. Це зумовлено здатністю кислотних форм реагентів утворювати комплекси з переносом заряду з речовинами, що містять у структурі
основний атом азоту.

На підготовчому етапі дослідження встановили: зопіклон, що має основний центр у молекулі, утворює забарвлений продукт за реакцією із сульфталеїновими барвниками.

Імовірно, в результаті реакції між зопіклоном, що має надлишок електронної густини на атомі азоту, та БТС, який є донором протонів, утворюється комплекс із переносом заряду. Про це свідчить поява нової смуги поглинання при 400 нм, яка відсутня на спектрі реагенту.

Отже, БТС реагує із зопіклоном в ацетоновому середовищі з утворенням забарвленого продукту жовтого кольору з максимумом світлопоглинання при 400 нм.

Оптимальну кількість реагенту обрали на основі максимального виходу продукту реакції. Температурний і часовий режими у цьому випадку не потребували корекції – реакція перебігає швидко і при кімнатній температурі. Розраховане значення молярного коефіцієнта 1,82×10^4 свідчить про високу чутливість реакції.

Для визначення співвідношення стехіометричних коефіцієнтів між зопіклоном і БТС використовували метод молярних відношень (метод «насичення») і метод ізомолярних серій.

Зопіклон взаємодіє з БТС у співвідношенні 1:1.

Загальна методика кількісного визначення димедролу гідрохлориду

Аліквотну частину (0,00028 г) ацетонового розчину димедролу вміщують у мірну колбу ємністю 10,00 мл, обробляють 2,00 мл 2,5% ацетонового розчину БТС і перемішують. Абсорбцію досліджуваного розчину вимірюють на фоні компенсаційного розчину, що не містить досліджуваної речовини, при 400 нм.

Аналітичне застосування сульфофталеїнових барвників відоме для кількісного визначення препаратів різних фармакологічних і хімічних груп. Це зумовлено здатністю кислотних форм реагентів утворювати комплекси з переносом заряду з речовинами, що містять основний атом азоту.

На підготовчому етапі дослідження встановлено, що димедрол має основний центр у молекулі, що надає йому можливість утворювати забарвлений продукт за реакцією з сульфталеїновими барвниками.

Виходячи з даних про розчинність димедролу та сульфофталеїнових барвників, проведено підбір розчинника для даної реакції. Експериментально встановлено, що найдоцільнішим є використання ацетону в якості розчинника, а бромтимолового синього – у якості реагента.